Montivipera wagneri ve M. raddei engerek türlerinin zehirlerinden L-amino asit oksidaz enziminin kısmi saflaştırılması

Abstract

Yılan zehrinin bir bileşeni olan L-amino asit oksidaz (LAAO), L-amino asidin α-keto aside oksidatif deaminasyonunu katalize ederek hidrojen peroksit (H2O2) üreten bir flavoenzimdir. L-amino asit oksidaz, apoptoz indüksiyonu, trombosit agregasyonu, kanama, hemostaz ile etkileşim, ödem oluşumu, antitümör, antiparazit, antienflamatuvar, antimikrobiyal, anti-HIV, antilayşmanyaz ve zehirlenme toksisitesi gibi çok çeşitli biyolojik aktivitelere sahiptir. Bu aktiviteleri, kanser ve AIDS gibi bazı hastalıklarda terapötik ajan olarak kullanılma potansiyeline gündeme getirmiştir. Bu tez kapsamında yapılan çalışmada Montivipera wagneri ve M. raddei zehirlerinden LAAO enziminin kısmi saflaştırılması gerçekleştirilmiştir. Bu amaçla jel filtrasyon kromatografisi ile fraksiyonlama yapılmıştır. Her bir fraksiyonun enzim aktivitesi substrat olarak L-lösin kullanılarak gerçekleştirilen spektrofotometrik ölçüm ile test edilmiş ve LAAO enziminin aktif olduğu fraksiyon belirlenmiştir. Ayrıca SDS-PAGE yöntemi ile iki tür için LAAO enzim aktivitesi belirlenen fraksiyonlardaki proteinlerin indirgenmiş ve indirgenmemiş olarak molekül ağırlıkları belirlenmiştir. Sonuç olarak M. wagneri ve M. raddei türlerinin zehrinde belirgin aktiviteye sahip LAAO enzimi bulunduğu tespit edilmiş, kısmi saflaştırılması gerçekleştirilerek enzimin yapısı ve aktivitesi hakkında bilgi edinilmiştir. Mevcut tez bu amaçla gerçekleştirilmiş ilk çalışmadır. Bu çalışma ile M. raddei ve endemik tür olan M. wagneri zehirlerinden LAAO saflaştırılması ve karakterizasyonunun yapılarak enzimin biyoteknolojik açıdan değerlendirilmesi için önemli bir adım atılmıştır.

L-amino acid oxidase (LAAO), a component of snake venom, is a flavoenzyme that catalyzes the oxidative deamination of L-amino acid to α-keto acid, producing hydrogen peroxide (H2O2). L-amino acid oxidase has a wide range of biological activities such as induction of apoptosis, platelet aggregation, hemorrhage, interference with hemostasis, edema formation, anti-tumor, anti-parasitic, anti-inflammatory, anti-microbial, anti-HIV, leishmanicidal and contribution to the toxicity. These activities have raised their potential to be used as therapeutic agents in some diseases such as cancer and AIDS. In this thesis, partial purification of LAAO enzyme from Montivipera wagneri and M. raddei venoms was carried out. For this aim, fractionation was performed by gel filtration chromatography. The enzyme activities of each fraction were tested by spectrophotometric measurement using L-leucine as substrate and the fractions with the LAAO enzyme activity have been determined. In addition, the reduced and unreduced molecular weights of the proteins in the active fractions of each species were determined by the SDS-PAGE method. As a result, it was determined that the venom of M. wagneri and M. raddei species contained LAAO enzyme with significant activity, and information about the structure and activity of the enzyme was obtained by partial purification. The present thesis is the first study carried out for this purpose. With this study, an important step has been taken for the biotechnological evaluation of the LAAO enzyme found in the venoms of M. raddei and the endemic species M. wagneri by its purification and characterization from these venoms.